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挥发性脂肪酸的测定(二)比色测定法

发布时间:2019-10-28 11:48人气:

1、测定原理

含挥发性脂肪酸的样液,在加热的条件下,与酸性乙二醇作用生成酯,此酯与羧胺反应,形成氧肟酸。在高铁试剂存在下,氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物,其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物——挥发性脂肪酸的含量成正比,故可用比色法测定。

2、测定方法

⑴ 试剂
① 1:1硫酸:浓硫酸(相对密度1.84,C.P.)加到同体积蒸馏水中稀释配制。
② 酸性乙二醇试剂:取30.0mL乙二醇(C.P.)与4.0mL配制的稀硫酸混合。
③ 4.5mol/L的氢氧化钠:称取180g氢氧化钠(C.P.)溶于水中,冷后以蒸馏水稀释至1L。
④ 10%硫酸羟胺溶液:称取硫酸羟胺(C.P.)10.0g,溶于100mL蒸馏水中。
⑤ 羟胺试剂:量取20.0 mL4.5mol/L的氢氧化钠,与5.0mL10%的硫酸羟胺相混合。
⑥ 酸性氯化铁试剂:将20.0g分析纯FeCl3 ·6H2O溶于500mL水中,准确加入20.0 mL浓硫酸,并以蒸馏水稀释至1L。
⑵ 测定程序
① 乙酸标准液的配制。精确称取乙酸(分析纯,相对密度1.045,含量99.0%)1.010g,以蒸馏水稀释至100mL,此溶液含乙酸10mg/mL。
准确吸取10 mg/mL乙酸标准溶液1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL,分别置于100.0mL容量瓶内,以蒸馏水定容至刻度,摇匀,即得100μL/L、500μL/L、1000μL/L、1500μL/L、2000μL/L、2500μL/L、3000μL/L的乙酸标准系列液。
② 标准曲线的绘制。取相对密度1.045的乙酸(分析纯)试剂,制成50mL/L、100 mL/L、500 mL/L、1000 mL/L、1500 mL/L、2500 mL/L、3000 mL/L的系列标准液,分别吸取0.5 mL分置于试管中(12.5cm×1.5cm),每瓶中准确加入,于沸水浴中加热3min,然后立即以冷水冷却;再加入2.5mL羟胺试剂,充分摇匀,然后,充分振荡混匀,以蒸馏水定容,用721型分光光度计以500nm波长测定其光密度,绘制标准曲线,以横坐标表示浓度值,纵坐标表示光密度值。
③ 样品的测定。以4000~10000r/min的离心条件,制取沼气发酵样品澄清液,吸取0.5mL样液置于试管中(12.5cm×1.5cm),准确加入1.7 mL酸性乙二醇试剂,充分混合,于沸水浴中加热3min,应避免试管与加热器壁直接接触。然后立即将试管置于冷水中冷却。加入2.5mL羟胺试剂,并混匀,放置1min,然后全部倒进盛有10mL酸性氯化铁试剂的25mL容量瓶中,用蒸馏水定容,并充分摇匀,静置5min,用分光光度计以500nm波长测定光密度。同样操作做空白试验1份。       计算

挥发性脂肪酸总量的比色测定法公式

3、注意事项

① 此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法,比蒸馏法测定更为简便、快速。除150mg/L以下的低浓度范围外,其测定值相对误差与气相色谱法测定总值的相对误差相近。
② 此法中的反应是在严格的pH值条件下进行的,最适pH值为1.6±0.1。pH值高于2.0时,色度加剧,pH值低于1.0时,颜色难以稳定,易消失。
③ 酸性己二醇试剂和羟胺试剂宜使用时配,也可在测定中配入。例如,以加入1.5mL己二醇和0.2mL稀硫酸来代替1.7mL酸性己二醇试剂,以0.5mL硫酸羟胺和2.0mL4.5mol/L的氢氧化钠来代替2.5mL羟胺试剂。
④ 如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/L时必须用氢氧化钠蒸馏提纯己二醇 。
⑤ 酸性氯化铁配制好后,应静置过夜,弃去沉淀。
⑥ 必须严格遵守操作规程,显色反应必须充分摇动。
⑦ 比色法没挥发性脂肪酸总量,方便快速,对于特定样品(特别是污水污泥体系)的准确度较高,适合于沼气发酵的常规分析。 

 


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